mercredi 21 octobre 2009
Des échantillons de plumes ont été obtenus pour 33 des 34 espèces d’oiseaux ciblées. Ces prélèvements de plumes ont servi à obtenir de l’ADN pour les principales espèces d’oiseaux qui peuvent être hôtes de tiques dans le système d’étude. Cet ADN a servi à valider la spécificité des sondes moléculaires servant à identifier génétiquement les hôtes des repas sanguin des tiques.
Un grand merci aux participants. Si quelqu’un capture un Pigeon colombin, des plumes seront bienvenues.
Vous trouverez ci-dessous une description du principe de l’étude, la technique utilisée, et les principaux résultats.
Pour commencer, je tiens à remercier l’ensemble des bagueurs ayant participé à la collecte de plumes. Cet échantillonnage a été réussi puisque j’ai reçu 33 des 34 espèces d’oiseau recherchées dont la totalité de celles qui étaient indispensables à nos travaux.
L’unité d’Epidémiologie animale de l’INRA de Clermont-Ferrand_Theix étudie les maladies transmises par les tiques. Afin de mieux comprendre la circulation dans la faune sauvage des pathogènes transmis par les tiques, il est indispensable de savoir sur quelles espèces d’hôte se nourrissent les tiques.
Pour cela nous avons importé au laboratoire de l’INRA une méthode de typage des restes de repas sanguin des tiques qui se base sur l’analyse de l’ADN contenu dans l’estomac des tiques. Le principe est de comparer cet ADN avec des copies complémentaires d’ADN (sondes) propres de chaque espèce hôte potentielle. La sonde avec laquelle l’ADN extrait s’hybride identifie l’espèce sur laquelle la tique s’est nourrie pour la dernière fois.
Plus techniquement : à partir d’ADN extrait de tiques récoltées en quête d’hôtes, on amplifie par PCR un fragment d’un gène présent chez tous les vertébrés mais polymorphe entre les genres et certaines espèces : le gène mitochondrial 12s. Le produit PCR est ensuite déposé sur une membrane sur laquelle ont été préalablement fixées des sondes, séquences complémentaires d’un fragment du gène mitochondrial 12s de différents espèces ou genres d’animaux que nous voulons identifier (« Reverse Line Blot Hybridization », (Humair et al., 2007). Si le produit PCR s’hybride avec une sonde d’une espèce, cela veut dire que le gène mitochondrial 12s de cette espèce est présent, donc que la tique s’est nourrie sur cette espèce. Une des difficultés de cette approche vient du fait que les restes de repas sanguins sont infimes chez les tiques que l’on peut prélever sur la végétation. Une autre difficulté relève du fait que la tique que nous étudions peut se nourrir sur potentiellement n’importe quel vertébré terrestre.
Dans le cadre d’un programme d’épidémiologie de la maladie de Lyme dans des forêts périurbaines de la région parisienne impliquant le MNHN, l’Institut Pasteur et l’INRA (Vourc’h et al., 2007), il est apparu nécessaire de créer de nouvelles sondes pour identifier un plus grand nombre d’espèces d’oiseaux.
La spécificité de ces nouvelles sondes a été évaluée par bioinformatique à partir de séquences publiées dans la banque « Nucleotide » du National Center for Biotechnology Information (GenBank) (tableau 1). Ce tableau met en évidence le nombre de mésappariements entre les sondes ciblant des genres ou des espèces d’oiseaux et les gènes 12S de différentes espèces d’oiseaux publiés dans GenBank. Plus ce nombre est important et moins l’hybridation est possible. Une sonde est spécifique d’une espèce donnée si le gène mitochondrial 12s ne s’hybride pas avec d’autres espèces et n’est sensible que si le gène mitochondrial 12s de cette espèce s’hybride à elle sans mésappariement.
L’objectif de la collecte de plumes était d’acquérir une quantité suffisante de plumes pour en extraire l’ADN de l’espèce d’oiseau échantillonné. Cet ADN a d’ores et déjà permis de vérifier concrètement les résultats obtenus en bioinformatique quant à la spécificité des sondes (figure 1). En outre j’ai pu évaluer la sensibilité de détection de chaque sonde en réalisant des dilutions cet ADN.
Il apparait que la plupart des sondes sont spécifiques d’un genre. Cependant il n’a pas été possible de réaliser une sonde spécifique des genres Phylloscopus, Sylvia et Aegithalos. Effectivement la composition des séquences d’ADN des gènes 12S de ces oiseaux est trop proche. Il sera donc impossible de différencier les espèces Sylvia borin, Sylvia communis, Aegithalos caudatus, Phylloscopus trochilus et Phylloscopus collybita sans analyser la totalité de la séquence de leur gène mitochondrial 12s. Du point de vue de la sensibilité de détection, cette technique permet de détecter la présence du gène mitochondrial 12s d’un oiseau à partir de 10pg d’extrait d’ADN total de cet oiseau.
Pour conclure cette technique est suffisamment sensible et les sondes existantes ou nouvellement crées sont suffisamment spécifiques pour identifier la plupart des oiseaux potentiellement source du repas sanguin des tiques dans notre secteur d’étude.
En perspective, pour valoriser cet échantillonnage de plumes, je procéderai au séquençage des gènes mitochondriaux 12s de Strix aluco, Dendrocopos minor, Luscinia megarhynchos, et Phoenicurus phoenicurus dont les séquences sont absentes de GenBank. L’obtention de ces séquences me permettra de réaliser de nouvelles sondes ciblant ces espèces si elles deviennent nécessaires.
Remarque : L’ensemble de vos frais postaux relatifs à l’expédition des plumes sera remboursé prochainement sous la forme d’envois d’enveloppes timbrées.
Sébastien Masséglia Unité d’Epidémiologie Animale Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) 63122 St Genès Champanelle France Tél : 0473 62 46 95 Fax : 04 73 62 45 48 Secrétariat : 04 73 62 41 48 Mail : massegli clermont.inra.fr
Références :
1. Humair PF, Douet V, Cadenas FM, et al. (2007) Molecular identification of bloodmeal source in Ixodes ricinus ticks using 12S rDNA as a genetic marker. J Med Entomol 44, 869-880.
2. Vourc’h G, Marmet J, Chassagne M, Bord S, Chapuis JL (2007) Borrelia burgdorferi Sensu Lato in Siberian chipmunks (Tamias sibiricus) introduced in suburban forests in France. Vector Borne Zoonotic Dis 7, 637-641.
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